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フレームワーク発展の方法を図解するブロック線図を含む。 フレームワーク発展の方法を図解するブロック線図を含む。 スーパーフレームワークを発展させるための分布状モデリングの方法を図解するブロック線図である。 スーパーフレームワーク発展用の考慮点のリストである。 クラスター発展の方法を図解するブロック線図である。 クラスター発展の方法を図解するブロック線図である。 データクラスターを発見する方法を図解するブロック線図である。 画像的表現用グローバルクラスタリング指数の計算方法を図解するブロック線図である。, スマホ ゲーム カジノ 無料. 均質ポリマー連鎖反応(POLYMER CHAIN REACTION ){ピーシーアール(PCR) }フラグメントの同定 本発明が均質ピーシーアールフラグメントの同定に適用された。本方法は最初 にデーエヌエイ溶解カーブ(DNA melting curve)の情報豊富な部分を同定し、 次いで該入力スペクトラムの情報豊富な部分集合を使用して最適モデルを発展さ せる。 背景 デーエヌエイフラグメント同定は伝統的にゲル電気泳動(gel electrophoresi s)により行われて来た。挿入染料(intercalated dyes)を使用する代替え方法 はあり得る時間と感度での利点を提案している。この方法は、加熱時2重螺旋デ ーエヌエイが変性する(捲きほごれる)と該染料蛍光量(dye fluorescence)が 減少することの観察に基づいている。温度に対する蛍光量をプロットする、最終 のいわゆる”溶解曲線(melt curve)”のデータ解析は該デーエヌエイフラグメ ントのユニークな同定のベースを提供する。しかしながら、該方法は、特定的デ ーエヌエイフラグメントの精確な同定を、他の非特定的フラグメントの存在及び 背景基盤(background matrix)からの蛍光ノイズの存在の両場合で、要求して いる。 スパイク(spiked)される食料サンプルの準備 この研究はピーシーアールを禁ずる知られる食料を評価した。該評価は、該禁 止食料の禁止効果を克服するために、該反応へのウシ血清アルブミン(bovine s erum alubumin){ビーエスエイ(BSA)}の添加能力をテストした。加えて、溶 解曲線解析を使用したピーシーアール製品の均質性検出が臭化エチジウム染色( ethidium bromide staining)を有する標準的ゲル電気泳動と比較された。 食料は地域の食料雑貨店で購入され、4℃で貯蔵された。30の異なる食料が ビーエイエム(BAM)手順で事前強化(per-enriched)された。処方された強化 法(enrichment)に従い、サンプルはサルモネラニューポート(Salmonella new port)でスパイクされるか又はスパイクされずに残されたが、表III参照。該 強化は次いでビーエイチアイ(BHI){デーアイエフシーオー(Difco)}内で1 :10に薄められ、次いで37℃で3時間培養された。 ポリビニルポリピロリドン(Polyvinylpolypyrrolidone){ピーブイピーピー( PVPP)}処理 グローバックサンプル(growback)の500マイクロリットル(500 ul)のア リコート(aliquot)がピーブイピーピー{クアリコン社(Qualicon, Inc.)} の50mgのタブレットを含むチューブに追加された。該チューブはボルテック ス(vortexed)されそして該ピーブイピーピーは15分間澄むようにされた。最 終浮遊物は次いで溶解過程で使用される。 サルモネラサンプルの準備 2mlのスクリューカップチューブ(screw cup tube)で、強化すなわちピー ブイピーピー処理サンプルの5マイクロリットルがデーエヌエイ挿入染料エスワ イビーアールグリーン(DNA intercalating dye SYBR R Green){モレキュラー プローブ(Molecular Probes)}の1:10、000希釈を含む溶解試薬{5m lビーエイエックス溶解バッフアー(5ml BAX R lysis buffer)と62.5ul (マイクロリットル)ビーエイエックスプロテアーゼ(62.5 ul BAX R Protease )}の200ul(マイクロリットル)に加えられた。該チューブは37℃で2 0分間次いで95℃で10分間培養された。95℃の培養の後、4mg/mlの ビーエスエイ(BSA)溶液の50ul(マイクロリットル)が該溶菌液(lysate )に追加された。これはピーブイピーピー処理済みと未処理のサンプルに行われ た。対照として、幾つかのサンプル未処理で残された。この未精製バクテリヤ溶 菌液の50マイクロリットルが、パーキンエルマー7700シークエンスデテク ター計器(Perkin Elmer 7700 Sequence Detector instrument)で使用されるピ ーシーアールチューブ内に含まれた1つのビーエイエックスサルモネラサンプル タブレット(BAX R Salmonella sample tablet)を水和するため使用された。該 チューブはキャップを付けられ、パーキンエルマー9600サーマルサイクラー (Perkin Elmer 9600 thermal cycler)内で次のプロトコルに依り熱サイクルに かけられた。 94℃ 2.0分 1サイクル 94℃ 15秒 35サイクル 72℃ 3.0分 72℃ 7分 1サイクル 4℃ ”長期間(forever)” 増幅後分析(Post Amplification Analysis) 増幅後、下記条件で運転することによりパーキンエルマー7700デーエヌエ イシークエンスデテクター(Perkin Elmer 7700 DNA Sequence Detector)上で 該溶解曲線が作られた。 プレートの種類: シングルリポーター(Single Reporter) 器械: 7700シークエンスデテクションシステム(7700 S equence Detection System) 運転: 実時間 染料層: エフエイエム(FAM) サンプルの種類: 未知である サンプル容積: 50ul(マイクロリットル) 運転条件: 70℃ 2分1サイクル データ収集せず 68℃ 10秒98サイクル データ収集する 自動インクレメント +0.3℃/サイクル 25℃ ”長期間” 該多成分データは該器械から移出され該分析に使用された。特定のデーエヌエ イフラグメントの製作は該アンプリフアイ(amplified)されたサンプルにビー エイエックスローデイングダイ(BAX R Loading Dye)の15マイクロリットルを 添加することにより検証された。次いで15マイクロリットルのアリコートが臭 化エチジウムを含む2%アガロースゲル(agarose gel)のウエル(well)内に 装填された。該ゲルは30分間180ボルトで運転された。特定の生成物は次い でユーブイトランスイルミネーション(UV transillumination)を使用して可視 化された。 データ分析 生の蛍光量(raw fluorescence)データが処理用にマイクロソフトエクセル( Microsoft Excel)に移入された。この段階からデータを可視化し該データから 予測をするため分岐的取り組みが使用された。 データ事前処理(Data Preprocessing) 蛍光ノイズを減らすために該データを事前処理することは成功するモデリング の尤度(likelihood)を増すことが実験的に決定された。該データ事前処理は次 の過程から成り、すなわち、 a.蛍光データ(fluorescence data)の正規化、 b.0.1℃の解像度でキュービックスプライン関数(cubic spline functio n)を用いた該正規化蛍光の内挿補間、 c.内挿補間された蛍光スペクトラムの対数を取る、 d.25点サビツスキーゴレイ平滑化関数(25 point Savitsky Golay smooth ing function)を用いた該蛍光の対数の平滑化、 である。 最終温度スペクトラムはここで説明されるモデリング方法への入力の集合とし て使用される。該温度スペクトラムを使用した2つの異なるモデリング例を説明 する。 過程a.データの正規化と可視化 該蛍光データは、最初にスペクトラム内の最低測定蛍光レベルを決定し、この 値を、直流オフセットを除くために、該スペクトラム内の各点から引くことによ り正規化される。上記の過程a.の正規化されたデータは次いでサビツスキーゴ レイの平滑化アルゴリズム(Savitzky-Golay smoothing algorithm)で平滑化され る。温度に対する平滑化蛍光の負の導関数{−dlog(F)/dT}が取られ 、−dlog(F)/dT(y軸)対温度(x軸)としてプロットされる。 過程b.該データからの予測 該正規化されたデータからスタートして、キュービックスプライン内挿関数( cubic spline interpolating function)を使用して0.1C分解能で該データ は内挿補間される。次いで該内挿されたデータの対数が取られ、次いで2.5度 (すなわち0.1℃で25の点)上でサビツスキーゴレイの平滑化アルゴリズム を用いて平滑化される。温度に対する該ログの蛍光の負の導関数が取られ{−d (logF)/dT}、サルモネラ用データ範囲:82.0℃−93.0℃(1 2データ点)を用いて1.0C間隔でパース(parsed)された。 方法比較用に、ここに説明された方法は2つの他の良く知られたモデリング方 法:ニューラルネットワーク及びロジスティック回帰(logistic regression) 、と比較され、結果は下表で報告される。 見出された最も有効なDNAフラグメント同定法は2つのモデリングスキーム をシーケンシャルな仕方で背中合わせで使うことを含んでいる。同定の第1レベ ルはスメア(smear)を非スメア(non-smear)から分離することである。これに 、非スメアサンプル用に関心のある特定のデーエヌエイフラグメントを同定する ことが続く。実際は、この階層的方法は、起こり得る出力カテゴリーを表す正、 負そしてスメアを有する1つの3状態モデルを使用するより精確であった。 1.特定ピーシーアールフラグメントに対する非特定ピーシーアールフラグメン トのモデリング 該ピーシーアールアンプリフイケーション過程(PCR amplification process )は、関心のあるデーエヌエイの特定の種類に対応するフラグメントのみならず 非特定ピーシーアールフラグメントも作る。第1例は本方法の該非特定と特定の ピーシーアールフラグメント間を区別する能力を展示する。149のロックされ たプロセス(すなわち、対照)特定的トレーニングスペクトルと、問題食料(ピ ーシーアール用で問題があると知られる実際の食料)の309のテストスペクト ルと、一緒に30の非特定的又は”スメア”の蛍光スペクトルのグループが創ら れた。0.1℃の温度分解能を有して、111点を含む各サンプル用の温度スペ クトル(11.1℃の範囲上の)が創られた。該ロックされたプロセスと問題食 料サンプルの両者が陽性と陰性の標本を含んだ。この例で、該陽性のサンプルは 特定のバクテリヤ(例えば、サルモネラ)でスパイクされ(すなわち汚染され) そして陰性のサンプルはスパイクされぬ(汚染されぬ)ようにされた。該スメア サンプルはロックされたプロセストレーニング集合(12スメアサンプル)と問 題食料テスト集合(18スメアサンプル)の両者にランダムに導入された。該陽 性及び陰性の両サンプル状態は合併され2進のゼロ”0”文字でラベル付けされ 、該スメアサンプル状態は2進の1”1”でラベル付けされた。 a.入力の最も情報豊富な集合を発展させること モデリング過程の第1歩は111次元の入力フイーチャー空間をより少ない、 より情報豊富な部分集合に減じることである。前に説明した発展型フレームワー クが該最も情報豊富なフイーチャーを発展させるために使用された。100の遺 伝子の初期遺伝子プールがランダムに発生され、そこでは各遺伝子は2進の11 1ビットの長さの記号列を有し、各ビットの状態は該対応入力フイーチャーが該 遺伝子内で賦活されたかどうかを表している。該発展過程はセル当たり1サンプ ルとなるべき平均セル占有数(mean cell occupation number)により抑えられ 、そして該発展は5世代より多く進んだ。各遺伝子の発展をドライブするために 、グローバルエントロピー、又は適応度関数としてローカルエントロピーの数加 重和(number-weighted-sum of local entropies)が使用された。該発展は固定 サイズ化された部分範囲(すなわち、適応型ビニングよりむしろ、固定されたビ ン)を使用して進みそして該データは、上記説明の様に、0及び1の出力状態の 数をバランスさせるようバランスさせられた。 発展型過程を通して該100の最も情報豊富な遺伝子のグローバルリストが保 持された。全ての111の入力フイーチャーのビット頻度のヒストグラムが、発 展した該情報豊富な遺伝子プール内で最も屡々発生するビットを同定するために 、該発展の各世代の終わりで分析された。このヒストグラムはどの温度点が該出 力状態に最も密接に付随したかについての情報を提供した。 該111の点の温度範囲が0から110までインデックス(indexed)され、 下記31温度点が該発展型過程から選択された:12,14,16,18,20 ,22,24,26,28,30,32,34,36,38,40,42,44 ,46,50,52,54,56,58,60,62,64,80,82,84 ,86,88。 情報豊富な領域が該ヒストグラム内で観察されそしてこれらの領域に懸かる偶 数番号インデックス点(上記リスト)が選択されたことは注意されるべきである 。大抵の該選択された点が12から60の範囲に懸かることは注意されるべきで ある。これは該スメアサンプル用溶解曲線スペクトラムが該ベースライン上に立 ち上がりそして該インデックス間隔[12,60]に対応する温度範囲内の陽性 及び陰性両サンプルから別れ始めるからである。例えスメアがそれらの正に規定 により可変溶解曲線構造を有するとは云え、主な構造的フイーチャーは該陽性の サンプル内よりも低い温度で一般に現れる。該陰性のサンプルは本質的に構造か ら自由である。かくして、本方法はより低い温度領域がスメアと非スメアの間の 最良の区別が起こる場所であることを確認する。 b.パース(parsed)されたデータの全低次元射影のエグゾーストな探索 第1発展型過程で発見された該情報豊富な点を使って該トレーニングデータ集 合がパースされた後、該減少したデータ集合は広いビニング範囲に亘り低次元で エグゾースチブに探索された。固定ビンとデータ集合バランシングが該エグゾー スチブな過程を通して使用された。このモデリング問題で、次元当たり26の固 定ビンを使用して全2次元射影内への該31次元入力空間の465の射影を発生 することが該最良エグゾースチブモデルに帰着することが分かった。W l 2 =10 、W l =5,定数項=1のエントロピー加重係数が使用された。しかしながら、 全465の射影を使用する該エグゾースチブモデルは、該射影の多くが情報より 多くのノイズを導入するので、最適モデルであることを保証されない。それで、 各ビットが該モデル用遺伝子プール内の与えられた2次元射影の包含(inclusio n)(2進で1)と排除(exclusion)(2進で0)を表す465ビットの長さの 2進記号列を使って第2の発展段階が行われた。

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